一、項目名稱：黃芪多糖對樹突狀細胞分化和功能的影響及抗腫瘤免疫機制的研究
二、研究工作對浙江經濟、社會和科技發展的意義
多糖具有廣泛的免疫調節功能和抗腫瘤作用，且無毒副作用或毒副作用較小，是一類很有開發價值的抗腫瘤天然藥物。樹突狀細胞（Dendritic cells, DC）是功能^強大的專職抗原提呈細胞（Antigen presenting cells, APC），參與抗原的攝取、加工及提呈，是機體免疫反應的始動者，在誘導初次免疫應答過程中具有獨特的地位，由于它在機體的抗感染免疫及抗腫瘤免疫應答中的作用極其重要而備受重視，成為近年來免疫學研究的熱點。
黃芪是一種傳統的補益類中藥，味甘、性溫，含有多種生物活性物質，其中黃芪多糖對機體免疫活性的調節功能尤為突出，它能夠提高細胞免疫及體液免疫，并對一些細胞因子具有一定的調節作用。
我國作為中醫藥學的發源國和中藥大國，有著深厚的中藥理論基礎，開發中藥多糖藥物具有獨特的優勢和良好的發展前景。我國傳統中藥的現代化技術標準體系的建立是中藥走向世界的一個重要步驟，也是中藥發展所必須解決的一個重要問題。在《中國未來20年技術預見研究》——生物技術領域技術課題中就指出將“采用基因表達指紋圖譜、化學成分指紋圖譜或生物活性指紋圖譜進行新型中藥的開發”，所以對中藥多糖的免疫調節機制進行研究，建立完整的中藥多糖調節機體免疫功能的指標體系是^重要的。真菌多糖類藥物的開發已有了較多的產品，而高等真核類生物多糖類藥物的開發卻鮮見報道，對它們的作用機制的分析也不夠完整。不同的多糖由于其分子結構的不同，其在抗原提呈細胞上的受體和產生的生物學效應也有所不同，研究黃芪多糖不同分子量的組分對DC功能以及抗腫瘤作用的影響，初步揭示DC在黃芪多糖抗腫瘤免疫中所起的作用及其作用機制，不僅具有良好的原創性和學術前沿性，而且為黃芪多糖抗腫瘤藥物的開發，開拓國際市場奠定理論基礎。浙江省為全國著名的經濟大省，具有很強的經濟勢力，百年老店胡慶馀堂和青春寶集團都是全國著名的中藥企業，為浙江省中藥事業的發展作出了重大的貢獻，并產生良好的社會效益，所以開發黃芪多糖類藥物，研究其作用機制，這對浙江中藥經濟的發展具有一定的推動作用，并將產生較好的經濟效益和社會效益。研究和建立黃芪多糖的免疫調節功能的指紋圖譜，對其它抗腫瘤多糖類藥物的質量標準的制定等都具有重要的意義。
三、本項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關系；
- 項目研究目標：闡述黃芪多糖對小鼠骨髓來源DC功能的影響，以及與抗腫瘤免疫的關系；建立黃芪多糖免疫調節功能的指紋圖譜。
- 申請者長期從事免疫學領域的研究，是浙江省中醫藥重點學科的主要成員，在中藥組分的分離、制備以及免疫功能調節方面進行了多年的研究，并發表了多篇研究論文。項目申請者和項目組的其他成員近年來對一些中藥組分（特別是中藥多糖）的免疫調節功能進行了較全面的篩選和初步研究，發現了一些組分具有比較特殊的免疫調節功能，黃芪多糖就是其中的一種，該項目的研究成果對其它中藥組分的功能研究也具有較好的推動作用。項目組的主要成員為浙江省中醫藥重點學科的主要成員，主要的工作目標就是通過幾年的研究積累，爭取獲得國家中醫藥的重點學科。所以本項目研究目標及與申請者研究工作長期目標是一致的。
四、項目研究內容，研究方案和進度安排
（一）、項目研究內容：
- 體外實驗研究黃芪多糖與DC的結合情況，研究黃芪多糖對DC的表面分子和細胞因子表達的影響，以及DC表面黃芪多糖的受體及信號轉導通路。
- 確定不同分子量的黃芪多糖的免疫調節功能的差異及相關的生物活性指紋圖譜。
- 整體動物實驗研究黃芪多糖對小鼠多種免疫指標（細胞免疫、體液免疫、非特異性免疫和細胞因子分泌）及抗腫瘤活性的關系。
（二）、研究方法、技術路線及實驗手段：
1. 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的培養和純化：脫臼處死6-8周齡 C57BL/6j(H-2b)小鼠，頸椎，取出股骨和脛骨，PBS反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，1000-1500轉/分鐘離心5-10分鐘，紅細胞裂解液裂解紅細胞，用PBS洗三遍后重懸于含30ng/ml GM-CSF 、20ng/ml IL-4以及10％胎牛血清的RPMI-1640培養液中，接種于6孔板，三天后，吸掉未貼壁的細胞、換液。第五天，采用MiniMACS免疫磁性分離系統純化樹突狀細胞。
2. 黃芪多糖與DC的結合：用熒光物質2-氨基吖啶酮標記黃芪多糖，在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃芪多糖與DC的結合情況；
3. 流式細胞儀分析黃芪多糖對DC表面標志分子表達的影響：收集純化并經藥物處理24 h后的DC，FACS緩沖液（含2％FCS和0.1％疊氮鈉的PBS）洗兩遍，于4℃下用10％的羊血清封閉細胞表面抗體15分鐘，然后加入PE標記的抗MHCⅡ（I-A/I-E）單克隆抗體和FITC標記的抗CD11c單克隆抗體，于4℃下溫育30分鐘，用FACS緩沖液洗三遍，然后用200μl FACS緩沖液重懸細胞置于流式細胞儀上檢測。
